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Unité de Nutrition Humaine

Zone de texte éditable et éditée et rééditée

Métabolisme et Spectrométrie de Masse

Responsable : Estelle PUJOS-GUILLOT

Contexte Scientifique

L’objectif des recherches clermontoises en Nutrition Humaine est d’améliorer la Nutrition de l’homme, notamment au cours du vieillissement. L’étude des métabolismes suscite un intérêt majeur puisqu’elle reflète l’intégration de l’ensemble des phénomènes post-génomes. Elle est fondamentale pour comprendre le fonctionnement des organismes vivants à tous les niveaux d’intégration de la cellule à l’écosystème. Cette nouvelle discipline à haut débit permet d’aborder les problèmes de biocomplexité en décrivant de façon exhaustive les métabolites générés ou modifiés dans certaines conditions nutritionnelles. Elle implique l’analyse par spectrométrie de masse d’échantillons contenant des matrices complexes (fluides ou tissus biologiques) et de métabolites à de faibles niveaux de concentration, outil que développe la plateforme.

L’équipe « Métabolisme et Spectrométrie de Masse » constitue un centre de ressource en spectrométrie de masse pour la métabolomique au sein de l’INRA, et est la composante principale de la Plate-Forme d’ « Exploration du Métabolisme » (PFEM). Cette plate-forme labellisée IBiSA en 2010, certifiée ISO9001 en 2008 et NFX50-900 en 2013 est un outil commun d'étude du "métabolome" environné, c'est-à-dire enrichi d'une capacité d'analyses en protéomique et transcriptomique. L’équipe est également l’un des quatre membres fondateurs de l’infrastructure d’excellence MetaboHUB (infrastructure nationale en métabolomique et fluxomique).

En tant que composante d’une plate-forme, l’équipe est une structure "transversale" entièrement dédiée aux études du métabolisme. Elle offre à la fois des prestations analytiques et des mises au point méthodologiques. Ses missions consistent à :

• mettre à disposition des compétences et des moyens techniques pour la réalisation de projets scientifiques

• fournir les expertises et les conseils nécessaires pour la définition, la mise en œuvre, la réalisation et la conduite de projets et d’analyses spécifiques

• assurer une veille technologique, en lien avec le développement de nouveaux outils et protocoles

• fournir une assistance technique aux utilisateurs

• proposer des formations initiales et continues, et effectuer une animation scientifique dans le domaine.

Approches analytiques développées

La plateforme possède une expérience historique dans le domaine de la fluxomique. Cette discipline consiste au suivi de métabolites spécifiques et en la détermination de leur vitesse de transfert entre compartiments cellulaires (ou plutôt tissulaires) qui permet de définir leur flux inter-organes. Les compétences de la plateforme dans ce domaine vont de la quantification de petites molécules présentes dans différents compartiments de l’organisme jusqu’aux mesures d’enrichissements isotopiques de molécules permettant d’accéder à leur débit métabolique, après administration de ces isotopes, utilisés comme traceurs biologiques, aux organismes.

La plateforme développe également actuellement l’utilisation de l’approche métabolomique. Cette nouvelle discipline, basée sur des analyses à haut débit permet d’aborder les problèmes de biocomplexité en décrivant de façon exhaustive les métabolites générés ou modifiés dans les conditions étudiées. Les compétences proposées aujourd’hui par la plate-forme dans ce domaine concernent la détermination de profils métaboliques  par des approches multiplateformes non ciblées afin d’obtenir une couverture analytique maximale du métabolome. De plus, elles consistent dans le développement de stratégies analytiques pour faciliter l’identification des métabolites (potentiels biomarqueurs), à la fois par l’utilisation de  la spectrométrie de masse très haute résolution et la réalisation d’outils bioinformatiques d’automatisation du traitement des données.

Équipements et savoir faire

Ce centre rassemble actuellement une dizaine d’appareils complémentaires en spectrométrie de masse et spectrométrie de masse isotopique. Six types de technologies sont présents sur la plateforme :

• GC-C-IRMS : couplage chromatographie gazeuse – combustion – spectrométrie de masse isotopique dédié à la fluxomique (mesures enrichissements très faibles) : analyses de gaz expirés, et d’acides aminés incorporés dans les protéines.

• GC-MS et GC-QqQ : couplage chromatographie gazeuse – spectrométrie de masse simple ou triple quadripôle, dédié à la quantification ou à la fluxomique d’une part (acides gras et acides aminés libres), et à la métabolomique d’autre part (profils métaboliques des eaux fécales).

• LC-QqQ et QTrap: couplage chromatographie liquide – spectrométrie de masse triple quadripôle ou quadripôle trappe d’ions, dédié à la quantification ou la fluxomique : analyses de micronutriments (polyphénols, caroténoïdes …) et d’acides aminés.

• LC-QToF et GC-QToF: couplage chromatographie liquide – spectrométrie de masse quadripôle / temps de vol, dédié à l’activité métabolomique : acquisition de profils métaboliques urinaires et plasmatiques

• LTQ Orbitrap : spectromètre très haute résolution, dédié à lidentification de biomarqueurs lors d’études métabolomiques.

La plateforme dispose de plus d’un accès aux appareillages suivants :

• Metabolic Profler (LC / RMN / ToF) : appareil dédié aux études métabolomiques (profiling, confirmation de structures), installé à l’Université B. Pascal, Clermont-Ferrand)

 Recherche propre

Les développements méthodologiques se rapportent à la préparation des échantillons, à l’analyse des métabolites, à leur identification et au traitement des signaux. En fluxomique, ils concernent principalement la quantification des enrichissements isotopiques par des approches MS/MS dans le but d’accroître la sensibilité et la spécificité des mesures. En Métabolomique, les développements concernent des optimisations et validations de méthodes d’analyse sur différentes matrices biologiques, ainsi que le déploiement d’outils analytiques et bioinformatiques pour optimiser et automatiser le traitement des données et l’identification des biomarqueurs.

Activités Bioinformatique et Biostatistiques

En appui de ses activités analytiques, la PFEM développe une expertise en BioAnalyse et en BioInformatique. Le groupe "BioInformatique & Statistiques" s'intéresse au prétraitement (filtre et nettoyage de données), aux analyses descriptives et inférentielles des données et au développement de stratégies in silico d'identification et d'annotation dans le domaine de la métabolomique. Les compétences regroupées au sein de la PFEM en informatique, développement logiciel, statistiques, et bioinformatique sont à l'origine de projet comme PeakForest, librairie en ligne de profils metaboliques (peakforest.org) et permettent de collaborer activement à différents projets nationaux et internationaux (portail collaboratif workflow4metabolomics, MetabOlism FramewOrk , base de données PhytoHUB).