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Dernière mise à jour : Mai 2018

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UMR GDEC

UMR 1095 Génétique Diversité et Ecophysiologie des Céréales

Biologie cellulaire et moléculaire du développement du grain de blé en conditions optimales et sous contraintes abiotiques

S. Mouzeyar [coord.], F. Bouzidi, A. Boulaflous, C. Girousse, D. Cormier, M. Sibaud, N. Allard

En conditions optimales, la phase précoce de développement du grain (phase de division cellulaire, durant environ 250°Cj) est fortement impliquée dans la taille finale du grain. A la fin de cette phase, il a été observé un fort ralentissement concomitant des fonctions physiologiques liées à l’accumulation de masse et d’eau dans le grain et liées à la fin de la multiplication cellulaire dans l’albumen. Cette phase est particulièrement sensible aux contraintes environnementales, notamment la température, qui peut fortement limiter la taille potentielle du grain notamment en diminuant le nombre de cellules accumulatrices des réserves dans l’albumen en fin de phase de division. Nous avons donc décidé de focaliser nos travaux sur les phases précoces de développement du grain après la fécondation. Les approches retenues font appel à l’écophysiologie, la biologie cellulaire, la biologie moléculaire et la biochimie. L’objectif principal est d’identifier les éléments clefs impliqués dans le développement du grain. Ces éléments clefs peuvent correspondre à des phases ou stades critiques, sensibles aux changements climatiques, à des compartiments cellulaires déterminants, mais aussi à des gènes et voies métaboliques importantes dans le déterminisme de la taille du grain dans des conditions optimales et des conditions de contraintes abiotique. Parmi les différents compartiments du grain, nous ciblerons d’une part l’albumen, dont la taille et le contenu constituent une composante importante du rendement et d’autre part, les couches périphériques (cross-cells, tube cells) qui exerceraient une contrainte mécanique limitant la croissance du grain. En résumé, nous souhaitons combiner des études à l’échelle cellulaire, tissulaire (albumen, couches périphériques) puis à l’échelle de l’organe (taille finale du grain). Ce travail sera conduit sur la lignée de blé Récital, cultivée dans des conditions optimales ou en conditions de température élevée/déficit hydrique.

Approches cyto-morphologiques

Nous proposons de poursuivre l’étude de l’effet de contraintes climatiques sur la taille potentielle et finale du grain et des ses compartiments en s’intéressant à l’application contrôlée de températures élevées (sous modalités variées) et de déficit hydrique post-floraison (avec ou sans interaction). En multipliant ainsi les modalités d’application de contraintes environnementales, nous souhaitons (1) établir des lois de réponse de la taille du grain aux facteurs environnementaux (2) développer, en collaboration avec l’équipe « BIG », un modèle de simulation sur la base de SiriusQuality1, permettant de simuler l’effet de facteurs environnementaux associés au changement climatique et (3) proposer des variables cytomorphologiques précoces et pertinentes corrélées à la taille finale du grain. Cette approche et les variables ainsi identifiées seront utilisées pour la caractérisation de plantes transgéniques sur-exprimant les gènes impliqués dans les processus de division cellulaire, ou bien de lignées isogéniques différents pour un QTL de taille du grain identifiées par l’approche moléculaire. Ce phénotypage sera facilité par l’acquisition fin 2010 d’un tomographe à rayons X qui permet l’accès de manière non destructive à une visualisation 3-D des volumes de compartiments du grain avec une très bonne résolution spatiale (quelques µm) et des temps d’acquisition rapides.
Par ailleurs, ces premières études associées à des données bibliographiques (Schnyder et Baum 1992) suggèrent que les couches périphériques interviennent dans le déterminisme de la taille potentielle du grain en limitant le volume interne disponible pour l’accumulation des réserves. D’autre part, des études sur le tournesol ont montré que des températures élevées pendant le développement des graines entrainaient des modifications importantes des couches périphériques, conduisant à des diminutions de masse de grains importantes. Ainsi, l’hypothèse du rôle des couches périphériques dans le contrôle de la taille potentielle et finale sera étudiée en suivant la cinétique de sclérenchymatisation de certaines assises des couches périphériques (cross cells, tube cells du péricarpe interne) par microscopie photonique ou spectrophotométrie UV (en collaboration avec BIA de Nantes). Cette cinétique sera complétée par des hybridations in situ de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des lignines en conditions normale vs température élevée.

Approches moléculaires

Le développement d’un organe comme le grain de blé est un processus complexe qui nécessite l’intervention séquentielle ou combinée d’un très grand nombre de gènes et de voies métaboliques. L‘identification de l’ensemble de ces voies et la modélisation de leurs rôles est un objectif important à atteindre. Cependant, cela nécessite l’accumulation d’une très grande quantité d’information et de résultats d’expériences. Par ailleurs, cela ne pourra se faire de manière complète tant que le génome de blé n’est pas entièrement séquencé. Parmi ces voies métaboliques, le métabolisme carboné (en particulier celui du saccharose), les voies de signalisation par les hormones, la voie Ubiquitine/Protéasome 26S (UPS) et le cycle cellulaire semblent jouer un rôle déterminant dans le poids du grain chez les céréales. Dans ce projet, nous focaliserons nos travaux sur les voies de régulations par les hormones, l’UPS et sur le cycle cellulaire. La démarche retenue peut être résumée par les étapes suivantes :
  1. Analyse transcriptomique des stades précoces de développement en conditions optimales et en conditions de température élevée.

  2. Les gènes différentiellement exprimés issus de cette analyse seront confirmés puis localisés par hybridation in situ haut débit. Seuls les gènes exprimés dans l’albumen et les couches périphériques seront retenus.

  3. Une analyse biochimique sera conduite sur les protéines codées par ces gènes, notamment les E3 ligases (voie UPS). Cette analyse comprend soit la mesure de l’activité enzymatique, soit la recherche d’interacteurs par des techniques d’interactions protéine-protéine (Y2H, BiFC, Immunoprécipitations, Pull-Down…).

  4. Ces gènes feront l’objet d’une validation fonctionnelle d’abord par génétique d’association, en utilisant les populations disponibles dans l’équipe et dans l’UMR. Ensuite, ceux des gènes qui présenteront une colocalisation avec des QTLs de poids de grains seront validés prioritairement par transgénèse (RNAi et surexpression) en utilisant la plateforme « Validation fonctionnelle » de l’UMR. Des collections de mutants (EMS et irradiation) pourront être également criblées. Le phénotypage de ces lignées sera réalisé sur la base des variables pertinentes issues de l’approche cyto-morphologiques.
Ces travaux permettront (1) d’identifier des gènes régulateurs du développement de l’albumen et des couches périphériques et (2) d’établir des relations entre ces différentes voies de signalisations et de proposer des modèles fonctionnels et prédictifs de la taille du grain de blé.
La réussite de ce projet est conditionnée par la disponibilité de plusieurs outils qui seront développés dans l’équipe : (1) la mise en place de culture de cellules de blé pour la production de protéines recombinantes, (2) une information exhaustive concernant les séquences complètes des gènes (extrémités 5’) qui pourra être obtenue soit en construisant des banques «cDNA full-length » soit par du séquençage massif de type RNASeq, et (3) le développement d’outils haut débit d’analyse des interactions protéine-protéine comprenant la construction de plusieurs banques Y2H et la mise en place de crible Y2H ou BiFC haut débit.